日立l-8900氨基酸主动阐发仪ppt
发布时间:2019-08-13   动态浏览次数:

  日立 L-8900 氨基酸从动阐发仪 ? 内容 氨基酸相关内容引见 氨基酸阐发仪成长及出产厂家 氨基酸阐发仪道理及响应部件 样品的制备 使用 ? ? ? ? ? ? 常见毛病的阐发取处置 调养 ? 一 氨基酸相关内容引见 ? 氨基酸(amino acid):含有氨基和羧基的一类无机化合物的通 称。是生物功能大卵白质的根基构成单元,是形成动物养分 所需卵白质的根基物质。 ? ? ? 含有碱性氨基和酸性羧基的无机化合物 氨基连正在α-碳上的为α-氨基酸 构成卵白质的氨基酸均为α-氨基酸 构成卵白质的 20 种氨基酸除甘氨酸外,都有一个不合错误称碳原子,即α-碳原子。 α-碳原子有四个分歧代替基:羧基、氨基、氢原子和 R 基团,分歧氨基酸的 R 基团分歧。 每种氨基酸有 D -构型和 L -构型,天然卵白质中的氨基酸都是 L- 构型。 普遍存正在于食物、药品、水产物、饲料和体液(血液、尿样) 氨基酸正在溶液中受溶液 pH 的影响存正在着下列均衡 等电点(pI):正在某一 pH 的溶液中,氨基酸解离成阳离子和阴 离子的趋向或程度相等,成为兼性离子,呈电中性,此时溶液 的pH成为该氨基酸的等电点。 分歧氨基酸等电点 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 丙氨酸 Ala (A)6.02 精氨酸 Arg (R)10.76 天冬酰胺 Asn (N)5.41 半胱酰酸 Cys (C)5.02 谷氨酰胺 Gln (O)5.65 组氨酸 赖氨酸 His (H)7.58 Lys (K)9.74 天冬氨酸 Asp(D) 2.98 谷氨酸 Glu (E) 3.22 甘氨酸 Gly (G) 5.97 亮氨酸 Leu (L) 5.98 蛋氨酸 Met (M)5.75 脯氨酸 Pro (P)6.30 苏氨酸 Thr (T)6.53 酪氨酸 Tyr (Y)5.65 异亮氨酸 Ile (I)6.02 苯丙氨酸 Phe (F)5.48 丝氨酸 色氨酸 缬氨酸 Ser(S)5.68 Trp (W)5.88 Val (V)5.97 氨基酸的化学性质 ? 氨基酸中都具有氨基和羧基,因而它们都能发生氨基取 羧基的一般反映,如脂化、甲基化、乙酰化以及酸碱的中和 感化等。有些氨基酸因为存正在其它基团而发生特殊反映,如 半胱氨酸的巯基(-SH) 茚三酮反映 茚三酮溶液取氨基酸共热,生成氨。氨取茚三酮和还原性茚三酮 反映,生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅取氨基酸的含量成 反比,可通过测定570nm处的光密度,测定氨基酸的含量。 ? 离子互换法分手阐发氨基酸的道理 按照氨基酸是两性电解质这一特征,以及目标氨基酸取 ? 杂质氨基酸 pK、pI 值的差别,操纵离子互换树脂对各 种氨基酸吸附能力的分歧进行分手纯化。 二 氨基酸阐发仪成长及出产厂家 ? 氨基酸阐发仪进入国内市场已有近三十年的汗青,它是公用于 测定卵白质水解液(水解氨基酸)及心理体液中(逛离氨基酸) 夹杂氨基酸含量的一种公用仪器,现已普遍使用于各行各业。 它取其他阐发仪器区别正在于只能检测氨基酸,不克不及做为他用, 具有性。 ? 1958年 stein 取moore 两人先后发现离子互换分手、茚三 酮柱后衍生氨基酸从动阐发仪。基于阳离子互换柱分手、柱后 茚三酮衍生、光度法测定的离子互换色谱法(IEC), 1972年 stein 取moore 两人同获诺贝尔。 IEC是当今国际尺度和国 家尺度以及仲裁和涉外的方式 。 氨基酸阐发仪出产厂家及常见型号 日立氨基酸阐发仪成长汗青 三 氨基酸阐发仪道理及响应部件 ? ? 氨基酸阐发仪根基阐发道理: 各类卵白质是由20种氨基酸首尾相连,并以必然的挨次构成肽链。用 水解的方式将肽链打开,构成单一的氨基酸进行阐发。所有的氨基酸 正在低pH值的前提下都带有正电荷,正在阳离子互换树脂上均被吸附,但 吸附的程度分歧,碱性氨基酸连系力最强、其次为芳喷鼻族氨基酸、中 性氨基酸、酸性氨基酸连系力最弱。按照氨基酸阐发仪设定的洗脱程 序,用分歧离子强度、pH值的缓冲液顺次将氨基酸按吸附力的分歧洗 脱下来(先酸性氨基酸再中性氨基酸最初碱性氨基酸),被洗脱下来 的氨基酸取茚三酮反映液正在加热的前提下反映(135度),生成可正在分 光光度计中570nm和440nm检测到的蓝紫色物质(仲氨生成浅物 质440nm检测),外标量。 氨基酸阐发仪洗脱过程 ? 1. 氨基酸正在pH 2.2的前提下都带正电荷,正在阳离子互换树脂上均被吸附, 但连系强度各不不异。 ? 2. 跟着缓冲液正在离子互换柱上流动,氨基酸不竭的被吸附、解吸附。因为 氨基酸性质的差别(酸碱性、极性、大小),吸附强度有差别。 ? 3. 分歧氨基酸取离子互换树脂的亲和力分歧:碱性氨基酸>芳喷鼻族氨基酸 >中性氨基酸>酸性氨基酸及羟基氨基酸。 ? 4.提高流动相pH值,氨基酸正电荷削减,吸附力削弱,最初从离子互换柱 上洗脱下来,洗脱挨次是酸性和带羟基氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基酸。 ? 5.氨基酸尺度溶液中各类氨基酸正在氨基酸从动阐发仪上被洗脱的挨次必然, 尺度液各类氨基酸的浓度必然,洗脱峰的面积必然,由此可计较出样品中 各类氨基酸的含量。 ? 凡是细分为两种系统:卵白水解阐发系统(钠盐系统)和逛离氨基酸 阐发系统(锂盐系统),操纵分歧浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸 锂进行梯度洗脱。此中钠盐系同一次最多阐发约25种氨基酸,速度较 快,基线平曲度好;锂盐系同一次最多阐发约50种氨基酸,速度较慢, 基线一般不如钠盐系统好。 离子互换树脂 ? 公用氨基酸阐发仪的色谱柱次要是以磺酸型强酸性阳离子互换 树脂为柱填料。强酸型阳离子互换树脂,它是由苯乙烯和二乙 烯苯聚合而成的。该树脂是由苯乙烯和二乙烯根基聚合后磺化 而成,球状树脂的粒度一般正在5-10μm之间,交联度多为8%- 12%。 ? 交联度大,树脂的网状布局慎密,孔隙度小,对离子进入 树脂有障碍感化,较大的离子底子不克不及进入树脂内部,如许就 能够提高树脂对离子的选择性。交联度大的适合用于量较 小的氨基酸分手;交联度小,树脂布局松散,孔隙度大,适合 用于卵白质、肽类的分手。 L-8900氨基酸阐发仪内部布局 日立L-8900氨基酸阐发仪的构成 日立L-8900氨基酸阐发仪阐发道理 ? 1. 样品中的氨基酸正在低pH的前提下,都带有正电荷,正在阳离子 互换树脂上均被吸附,但吸附的程度分歧,碱性氨基酸连系力 最强,其次为中性氨基酸、酸性氨基酸连系力最弱。 ? 2.按照氨基酸阐发仪设定的洗脱法式,用分歧离子强度、pH值 的缓冲液顺次将氨基酸按吸附力的分歧洗脱下来。 ? 3.分手后的氨基酸取茚三酮试剂正在高温反映器中进行衍生反映, 生成能够被分光光度计检测的有色物质,然后正在检测器中被检 测出来。 日立L-8900氨基酸阐发仪流程图 阐发实例:啤酒酵母 实例阐发:猪排 实例阐发:一般血清 实例阐发:苯丙酮尿症血清 实例阐发:苹果汁 L-8900 氨基酸阐发仪机能目标 以卵白质水解液尺度阐发方式为例: 净阐发时间:≤30分钟 检出限:3pmol (信噪比=2,天门冬氨酸) 保留时间沉现性: ≤ CV 0.3% 峰面积沉现性: ≤1.0%(甘氨酸、组氨酸) 氨基酸阐发仪特点 ? 1. 活络、快速、供给数据精确靠得住、分辩率高、操做简单、 阐发周期短(水解30分钟、体液110分钟)。 ? ? ? 2.保留时间、峰面积、沉现性好,检出限可达3pmol。 3.不存正在液相方式生成二级衍生物的问题。 4.峰形显高斯分布,系统不变快(半小时即可) 氨基酸阐发仪按其分手和检测方式的分歧可分为两大类型, 第一类是基于阳离子互换柱分手、柱后茚三酮衍生光度法 测定的典范方式(IEC)。第二类是所有基于反向色谱分手、 柱前衍生、荧光或紫外检测的高效液相色谱法(HPLC)以 及经阴离子互换分手间接安培法检测的离子色谱法(IE)。 氨基酸阐发仪法取HPLC法比力 ? 近年来,常见的检测氨基酸的液相方式不少,现将几种常用的方式 取氨基酸阐发仪法进行比力: ? ? (一)OPA法(邻苯二甲醛)(反映机理略) 不脚之处:做全阐发时需配以其他手艺一路利用,方可带有取仲氨 基团的氨基酸进行反映。赖氨酸及胱氨酸衍生物荧光较弱,活络度 低。由于OPA是快速反映剂,有些氨基酸反映及其不不变,出格是 甘氨酸、赖氨酸衍生物的信号衰减很快,一天变化很大。按照材料 显示,此方式的变异系数CV%一般为5%摆布,个体氨基酸如组氨 酸可达9%摆布,特别对带有盐分的饲料氨基酸类样品出格不合适, 因样品中带有盐分间接影响衍生(紫外发基线欠好)。 ? ? (二)PITC法 (异硫氰酸苯脂)(反映机理略) 此方式的沉现性较着低于茚三酮法,最大错误谬误是: 一个组分衍生后可生成2个以上的衍生物。并且和其 他组分峰堆叠,活络度比力低。因为有残留的衍生 剂,柱效取柱寿命降低很快(200个样品摆布),变 异系数正在4%摆布,个体氨基酸如组氨酸可达8%, 某些氨基酸正在24小时内即被降解。 ? ? (三)D-CL法 (丹酰氯) 反映比力简单,以5个 mol/L 比例,正在室温、避光前提下短时间即 可完成反映。 ? 错误谬误:衍生物对紫外比力,反映必必要正在避光下进行,赖氨酸、 组氨酸和半胱氨酸均生成二级衍生物影响精确丈量。 ? ? (四)2,4-二硝基氟苯法 此方式是比力常见的液相测定方式,最大错误谬误是衍生剂峰比力大, 对柱子风险比力厉害。组氨酸分手欠好、组氨酸的二级衍生物取丝 氨酸堆叠,另一个峰柱效降低时完全融入到前面苯丙峰中,间接影 响定量,时间变化比力大。 氨基酸阐发仪取HPLC常规比力 四 样品的制备 ? ? 1. 卵白质的水解 2. 逛离氨基酸样品的制备 卵白质的水解 ? 用于全氨基酸测定的样品,凡是以卵白质形式存正在的都有进行水解处 理,水解方式有三种: ? 1.酸水解法:尺度水解法,是遍及采用的水解方式,正在水解过程中采 用6N 的盐酸做为水解剂,此方式的特点是水解完全,水解后的氨基 酸全数以L-型形式存正在,但色氨酸遭。(6N HCL 、110℃线小时) ? ? ? 长处:HCL本身加热能够蒸发除掉。 错误谬误:溶液显黑褐色、取含醛基化合物感化的成果。 提醒:盐酸中的沉金属,做为接触剂可使氨基酸遭到,故要求高 纯度的盐酸水解样品。 2. 碱水解法:用2.5N NaOH (氢氧化锂)做为水解剂,色氨酸 不被,但有消旋感化,丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、胱氨酸 遭到分歧程度的(水解时20小时) 长处:水解液清澈 错误谬误:氨基酸发生外消旋感化,水解产品氨基酸有L-型和D-型, 水解过程中会放出氨气和硫化氢。 提醒:只是为了测定卵白质中色氨酸含量才会采用此水解方式。 ? 3. 酶水解法:酶是无机催化剂,它不需要高温高压,而是正在常温常压 下即可催化无机物质的合成取分化。 ? 长处:水解前提暖和,无需特殊设备,氨基酸不受,产品中除氨 基酸外另有较多肽类,目前来说,没有一种酶能全数完全水解卵白质, 取酸法比力酶法要考虑酶试剂的品种、量、温度、pH值等要素,此 方式次要用于出产水解卵白及卵白肽。 ? 错误谬误:水解时间长、并且不易水解完全。 ? ? 提醒:做为氨基酸全阐发不成采用此法。 目前日本、欧洲和我国动物卵白水解出产上采用的工艺均为酸水解法 ? 4. 微波消解法:微波消解手艺,近年来正在化学范畴特别是正在氨基酸 样品前处置方面显示出了优良的使用前景。 ? 微波水解前提:体积30毫升摆布高强度、耐侵蚀和透射微波的容器, 水解温度150-160℃,水解时间30分钟。 ? 长处:水解时间短,适合多量量的样品前处置。(此法有待于同业 的承认及尝试比对数据的论证) 逛离氨基酸样品的制备 ? 逛离氨基酸的样品正在阐发前必需进行磨碎、脱脂、提取、脱盐、 去卵白、脱色等处置。正在进行阐发前利用C18过滤柱处置。 心理体液样品的处置 ? 心理体液的样品起首要除去样品中的卵白质,获得逛离氨基酸。除去 卵白质化学方式为: ? ? ? ? 1. 苦味酸法 2.三氯醋酸法 3.乙醇沉淀法 4.磺基水杨酸法 影响氨基酸阐发的各类要素 ? ? ? ? (1)样品中氨基酸浓度的影响 (2)缓冲液 pH 值、钠离子浓度的影响 (3)柱温的影响 (4)氨的影响 ? ? (5)氧存正在的影响 (6)光源的影响(钨灯) (1)样品中氨基酸浓度的影响 ? ? ? 每种仪器都有其比力合适的进样量,进样浓度都有必然的范畴, 本仪器要求,样品的进样量以坐标的高度100mv 为宜。 浓度太大太小都不合适,特别是将高浓度的样品注入仪器中会形成仪 器管的堵塞,超量程工做对柱子污染、负荷也较大。最好进样阐发 前将样品稀释到比力合适的浓度(0.02-1mmol/L)。 (2)缓冲液 pH 值、钠离子浓度的影响 ? 色谱图中各类氨基酸分手的出格好而没有峰丢失,缓冲液的 pH 值和钠离子起着主要的感化。日立氨基酸阐发仪仿单中 明白了其所有所用缓冲液的成分取配方,应严酷按其要求 配制,出格是 pH 值和钠离子浓度不妥会呈现氨基酸出峰会提 前错后以及堆叠现象(需要时以分手谱图为最佳准绳可按照具 体环境自行节制调整) (3)柱温的影响 各类分歧型号的氨基酸阐发仪都有各自柱温的要求,正在操做上一般要 ? 求柱温达到的温度基线不变当前,方能进行样品的一般阐发,否 则会呈现基线漂移影响分手结果以及精确定量。日立氨基酸阐发仪柱 温为57℃,如把柱温提高几度则各类氨基酸的溶出速度会加速,难分 离的氨基酸会形成分手不到位现象,分手度欠好。如把柱温降低几度, 氨基酸溶出速度会变慢,柱压会升高,峰形不都雅,会形成峰形变宽 出不完全的现象,耽误了阐发时间。 ? 受柱温影响比力大的氨基酸有:蛋氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸等。 (4)氨的影响 ? 缓冲液、样品、流系统混入氨时,可使基线正在碱性氨基酸出峰处将基线 抬高,影响碱性氨基酸分手结果和精确定量。氨的次要来历正在离子水出产 过程中混入的,再则试剂品级欠好也有带人微量氨的可能性。正在阐发过程 中当 pH 值低时氨被树脂所吸附,跟着缓冲液 pH 值的逐渐升高逐步被洗 脱下来,而正在苯丙氨酸后碱性氨基酸部门把基线抬高,使赖氨酸、组氨酸、 精氨酸分手定量受必然的影响。为领会决这一问题日立氨基酸阐发仪采纳 了一项新的办法:除氨柱中拆有对氨有选择性吸附的2650树脂,使氨被吸 附住,防止它正在阐发过程中被洗脱出来,吸附正在除氨柱上的氨,正在阐发过 程平分离柱利用B5(再生液)再生时,氨被洗脱掉,2650树脂又回复复兴, 因此除氨柱可反复利用但有必然量的寿命刻日。 (5)氧存正在的影响 ? 日立氨基酸阐发仪的缓冲液、反映液、再生液等容器的液面都充满氮 气使这些试剂取空气,最次要的是反映液中茚三酮最忌氧,茚三 酮氧化后即变质失效,所以茚三酮购入后必然要妥帖保管,出格是不 能正在空气中长时间。缓冲液中的消融氧也会对茚三酮显色结果制 成影响。正在设置装备摆设茚三酮试剂时,应留意要通入脚够时间的氮气以解除 氧,并且试剂概况应充满氮气,不克不及让设置装备摆设好的R1、R2开盖暴 露正在空气中,茚三酮反映液的黑白间接养分氨基酸出峰面积的大小、 间接影响氨基酸阐发的成果。 (6)光源的影响(钨灯) ? 因为氨基酸浓度分歧取茚三酮反映液反映生成的蓝紫色物质 颜色,深浅是纷歧样的,因此氨基酸的浓度取DYDA的接收 度成线性关系。也就是通过接收率反映氨基酸浓度的大小, 当光源欠安时,会间接影响精确阐发,活络度也会降低,到 达时间该当改换灯。 五 使用 ? ? ? (一)医学上的使用 (二)饲料上的使用 (三)农业、食物、饮料及其它 医学上的使用 ? 操纵氨基酸阐发手艺,姑苏大学医学院正在《氨基酸代谢取肝脑病》一 文中,从氨基酸代谢非常角度阐述了氨基酸取肝性脑病的关系。正在 《脑疾病取逛离氨基酸的研究》的课题中对肝性脑病取氨基酸的关系、 乙型脑炎取氨基酸的关系、儿童智力不全取氨基酸的关系、脑瘫取氨 基酸的关系、以及脑衰老取氨基酸的关系等方面都有相当程度的可喜 。 ? 山东大学生命科学院颁发的《低智儿童取一般儿童中氨基酸的比力研 究》一文着沉阐述了血清中11种逛离氨基酸的降低可间接影响人体组 织的一般发育、发展,从而导致儿童智力发育不全。 二军大、天津总院多家医学单元操纵氨基酸阐发手艺确定了人 体血高半胱氨酸含量的升高可导致动脉软化及血栓的构成。为 医疗诊断病因供给了靠得住的根据。 仅需26分钟,就能够做取动脉软化、枫糖尿病、高蛋氨酸血症等相关的 氨基酸成分和乙酰赖氨酸的阐发。 50多种氨基酸的丈量方式对心理体液中的次要氨基酸进行全面检测,为临床诊 断供给了一个无效手段。 饲料上的使用 ? ? 质量节制 线微升 鱼粉水解液尝试图 农业、食物饮料及其它 抽芽的大豆酿制的豆乳 六 常见毛病的阐发取处置 ? 毛病1: 泵1、泵2的显示压力都偏高。一般工做时,泵1的工做压力不 跨越10kgf/cm2(1kgf=9.80665N),泵2的工做压力不跨越0.1kgf/cm2, 而此时工做坐用户界面上显示泵1、泵2的工做压力远远跨越了这个限 值,并且不不变。管的压力过高,一般为管内被堵惹起的,而泵1、 泵2的压力同时过高,毛病很可能发生正在二者的公共管通道上。拆开 反映柱取夹杂器的接头,此时泵1,泵2的工做压力敏捷下降为一般值(泵 1为5.1kgf/cm2,泵2为0.03kgf/cm2)。申明反映柱前管一般,毛病发 生正在反映柱及其当前的通道上。拆开反映柱,发觉其取夹杂器接头处 的过滤网有很多污物,用蒸馏水频频清洗后,拆回,工做一般。 ? 毛病2:仅泵1压力过高。因泵2的压力一般,能够必定毛病范畴正在泵1 取夹杂器之间的管部门。先把分手柱头分隔,泵1压力仍偏高,再把保 护柱断开,此时泵1压力下降为3.5kgf/cm2,申明毛病发生正在柱里, 查抄发觉柱柱头的金属过滤网被净堵,拆下用蒸馏水清洗后再拆 回,管压力一般。 ? 毛病3:泵1、泵2 压力过低,并且不稳,经查抄除氨氮气压力一般(为 0.35kgf/cm2,整个管没有较着漏液处,排放阀也已关紧,但正在封闭排 放阀时,感受比力松动。拆下排放阀,发觉排放阀的密封圈已破损。因 无备件,就用薄橡便宜了一个O型密封圈拆上后,泵1、泵2压力稳 定一般。 ? 毛病4:样品阐发成果,基线来回跳动,波峰不稳。查抄泵1、泵2 工做压力和流量均一般不变,解除了泵的脉流大而影响基线的可 能性。短接分手柱后,毛病仍然,申明分手柱工做一般。拆下光 电比色池发觉被污染,先用蒸馏水清洗,然后用丙酮清洗,再用蒸 馏水,清洗清洁后拆上,开机沉试,毛病解除。 七 调养 氨基酸阐发仪属公用液相色谱仪,其常见的流毛病无非 是“堵”和“漏”两个方面,而更头要的是“堵”。要想 无效的防止和肃除流堵塞的毛病就必需服膺“病从口入, 防止为从”这八个字。下面从三个方面来阐述。 ? 一、把住入口关,谨防病从口入 杂质进入氨基酸阐发仪的渠道有三个,从进样器随样品进入,随缓 冲液进入,随进样器洗涤液进入。按照这三种环境,采纳响应的办法, 环节是要牢牢把好“三关”。 一是样品处置关。严酷按照法式处置样品,出格对心理体液样品,更 需小心隆重,加沉淀剂必然要过量,离心所用时间宁长勿短,最初, 必然要用0.22μm超滤膜进行超滤后方可上机,以防树脂的污染和柱 头的堵塞。 ? ? 二、缓冲液 这个环节往往被忽略,由于,正在配制试剂时,往往都用滤纸进行 过滤,过滤后的试剂虽有用不克不及发觉的异物,但现实上,液体 中仍存正在着很多细小的颗粒和污染物,这些小的微粒有着很强的附 出力,如不竭根将形成泵过滤器、管、柱头及比色池的污染和堵 塞。柱头中的过滤器是用金属烧结而成的,它具有很小的孔径(约 0.2μm),若是溶液中有大于该曲径的微粒存正在,将会惹起过滤的堵 塞或部门堵塞,轻者导致泵压升高,沉者使阐发柱完全堵塞。为此, 配制缓冲液的法式该当是如许的:起首,用360目标尼龙沙网过滤 缓冲液(粗滤),然后,用全玻璃的溶液过滤器拆上0.45μm的微孔滤 膜进行超滤。配制茚三酮的缓冲液也应按上述法式进行。 ? ? 三、进样器洗涤液 工做时,洗涤液要每日必换。为了防止尘埃、虫豸或其它杂质等 异物的落入,最好制做一个无机玻璃面罩,罩正在从动进样器 (参考尺寸为:50cm×38cm×19cm),并正在面罩前手下边20cm 处留一小孔,以便引入吸样泵取吸样针之间的连线。

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