氨基酸主动阐发仪
发布时间:2019-08-08   动态浏览次数:

  第三十八章 氨基酸从动阐发仪 概述 ? ? ? 本色:高效液相色谱仪 填料:强酸型阳离子互换树脂 检测器:可见或荧光分光光度计 选择性好、精确度高 阐发速度快,活络度高 概述 ? ? ? ? 20世纪40年代,起头根究色谱法 阐发氨基酸; 提高洗脱流速、改良柱曲径、填 料粒度,提高阐发速度; 20世纪80年代,键合反相分派色 谱、柱前衍生手艺的成长; 目前,共同微机节制法式和处置 数据,成为氨基酸最精确靠得住的 分手测试方式。 概述 本章次要内容 1、保守离子互换色谱公用氨基酸 阐发仪 2、柱前衍生反相高效液相色谱的 氨基酸阐发 ? 第一节 根基道理 ? 先将氨基酸夹杂物正在离子交 换树脂柱长进行分手,然后 按照分手后的氨基酸衍生。 按照衍出产物的特征,选择 恰当的检测器检测并进行定 性取定量阐发。 1.1 离子互换树脂 1.填料:磺酸型强酸阳离子互换树脂 2.苯乙烯为从体; 3.离子互换的活性基团:磺酸根(连 接正在苯乙烯中乙烯基的对位上); 4.取二乙烯基苯交联,构成不溶的高 骨架,易吸水消融。 5.交联剂所占比例决定网状布局的孔 径大小(氨基酸:8%~12%的交联 度)。 6.Na+型(卵白质水解液中的氨 基酸阐发),Li+型(全数氨 基酸的阐发) 7、考虑磺化程度、交联剂纯度 和类型、粒度大小 (5~10um)。 1.2 氨基酸正在色谱柱中的分手 1、分歧的氨基酸,其等电点、极性及 相对证量大小分歧,其洗脱挨次 分歧; 2、一般先后挨次: 酸性和带羟基的氨基酸(最早) 中性氨基酸(其次) 碱性氨基酸(最初) 3、同类氨基酸中,短链氨基酸先被洗 脱; 4、碳数不异的氨基酸,有支链的比无 支链的先洗脱出来。 1.2 氨基酸正在色谱柱中的分手 ? 氨基酸的分手影响要素: 离子互换树脂的型号、粒度、交 联度; 柱长、曲径、柱温; 洗脱液的阳离子类型、PH值、离 子强度、洗脱梯度、流速及此中 无机溶剂含量。 1、3 ? 衍生及检测 大都氨基酸无生色基团,正在紫外可 见光区无接收(Phe、Trp、Lyr例 外),需要将它们衍生,成为具有 紫外、可见光接收或能发生荧光的 物质才能够检测。 1 、3 衍生及检测 衍生体例: 1、柱前衍生法: 将AA夹杂物先衍生后,正在用反相 分派 色谱法分手,测定其紫外接收或发生的 荧光强度。 2、柱后衍生法: 将AA夹杂物用离子互换色谱法分手,正在 把分手后的氨基酸衍生为具有可见接收 或发生荧光的物质,然后测定。 1 、3 ? 衍生及检测 常用的衍生方式: 大都氨基酸取水合茚三酮正在弱酸前提下共 热,惹起AA的氧化脱氨、脱羧反映,水 合茚三酮取氨合还原茚三酮反映,生成紫 色DYDA,最大接收570nm(脯氨酸取羟 脯氨酸破例,生成化合物,最大接收 440nm)。 最初按照吸光度取峰面积的关系定性定量 阐发。 (1)茚三酮法 1 、3 衍生及检测 (2)邻苯二甲醛(OPA)法 AA分手后,可取邻苯二甲醛夹杂,正在常温、 乙硫醇或?-巯基乙醇存正在成一种强荧 光物质。 该衍生物正在激发波长340nm、接收波长 455nm,可用荧光光度计检测其发射的荧 光。 此外,脯氨酸取羟脯氨酸需要正在氧化剂 (NaClO)感化下,开环变为一级胺,然 后取OPA反映。 第二节 氨基酸阐发仪的结 构机能 ? 2、1 布局取流程 见图38-7 (p181) 洗脱安拆 衍生液 色谱柱(控温) 夹杂室 反映器 检测器 工做坐 第二节 氨基酸阐发仪的结 构机能 ? 2、2 次要部件功能 (1)输液系统 构成:泵、切换阀或梯度洗脱安拆; 感化:输送缓冲液、衍生试剂、 再生液; 要求:流量恒定、流速不变、较高的输出 压、输出流量范畴大。 第二节 氨基酸阐发仪的布局 机能 (2)进样分手系统 构成:进样器、色谱柱 AA最佳分手温度:30~70度, 需恒温,一般柱温升高,出峰时 间缩短。 第二节 氨基酸阐发仪的布局 机能 (3)检测系统 取决于AA衍生的体例: 茚三酮法,柱后衍生。茚三酮取分手后的 AA夹杂并正在100摆布的水浴中反映15min, 最初由紫外检测仪检测。 OPA法,分手柱流出液取NaClO夹杂,再 取OPA夹杂,生成荧光衍生物,采用荧光 光度计阐发测定。 第二节 氨基酸阐发仪的布局 机能 (3)法式节制系统 (4)数据处置系统及其他辅帮 系统 常见的仪器的次要机能:见表38-4 (p183) 第三节 试样的前处置方式 3、1 上机阐发试样液的要求 试液通明无可见杂质,放置或离心不发生 沉淀; 试液无色或略带浅,不然需脱色处置(活 性炭对芳喷鼻族AA有吸附,导致检测成果偏 低); 含盐量要低; 无卵白质或肽类物质(水解充实); 以PH2。2为宜; AA浓度以0。144mg/mL(1~10ng/50ul)为 宜。 第三节 试样的前处置方式 ? 3、2 试样前处置的方式 (1)酸水解 盐酸水解法 被的:Met、Trp; 不易水解:Ile、Leu、Val。 过甲酸氧化法 第三节 试样的前处置方式 (2)碱水解法 (3)血清取心理体液样品的处置 方式 血清样品:插手磺基水杨酸钠,混匀, 超高速离心,取上清夜。 心理体液样品:除去卵白质、脱盐、脱 色。

  氨基酸从动阐发仪_化学_天然科学_专业材料。第三十八章 氨基酸从动阐发仪 概述 ? ? ? 本色:高效液相色谱仪 填料:强酸型阳离子互换树脂 检测器:可见或荧光分光光度计 选择性好、精确度高 阐发速度快,活络度高 概述 ? ? ?