氨基酸阐发根基道理与使用
发布时间:2019-08-06   动态浏览次数:

  氨基酸阐发根基 道理取使用 目次 一、氨基酸阐发仪 ? 二、根基道理及特点 ? 三、样品的制备 ? 四、影响氨基酸阐发的各类要素 ? 五、使用 ? 日立L-8900氨基酸阐发仪 (一)氨基酸阐发仪的形成 1、输液单位(泵取管) ? 2、进样单位(从动进样器) ? 3、分手单位(离子互换柱、柱温箱) ? 4、反映单位(反映柱、反映温度加热设备) ? 5、检测单位(分光光度计) ? 6、法式节制、数据处置(工做坐) ? (二)氨基酸阐发仪的特点 ? ? ? ? 1、高活络度:以卵白水解液尺度为例可检测到 3pmoL。 2、快速、高分辩率:水解氨基酸阐发时间只要30 分钟,心理体液110分钟。 3、柱后衍生手艺(及时夹杂):取氨基酸反映前 才将两种反映液进行及时夹杂,无效的耽误了反 应液的利用刻日、且不需要额外的制冷安拆存放。 4、氨气解除系统:添加了除氨柱,能很好的解除 氨正在阐发过程中对基线及峰形的干扰。 二、根基道理 ? 氨基酸 R H _ C _ COOH NH2 _ 构成卵白质的20种氨基酸除甘氨酸外、 都有一个不合错误称碳原子,即а-碳原子。 а-碳原子有四个分歧代替基:羧基、 氨基、氢原子和R基团,分歧氨基酸 的R基团分歧。 每种氨基酸有D-构型和L-构型,卵白 质中的氨基酸都是L-构型。 _ (一)氨基酸的分类 它的分类有两种: ? 1、按氨基酸具有的酸性和碱性基团的几多 分类:中性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨 基酸。 ? 2、按人体养分的需求又可分为必需氨基酸、 半必需氨基酸及非必需氨基酸。 ? (二)氨基酸的化学反映 ? 取茚三酮反映:茚三酮取氨基酸一路加 热,构成深兰紫色复合物,最大接收波 长为570nm。 茚三酮取羟脯氨酸反映不NH3,曲 接生成化合物,接收波长正在440nm。 (三)氨基酸阐发仪根基阐发道理 1、离子互换柱 ? 2、离子互换树脂 ? 3、离子互换道理 ? 1、离子互换柱 氨基酸阐发仪的核心部件就是离子互换 柱,次要靠它把具有共性而又有不同的 各类氨基酸夹杂物分分开来进行定量。 ? 日立氨基酸阐发仪互换柱为磺酸型阳离 子树脂分手柱。 ? 2、离子互换树脂 用做氨基酸分手柱的固定相一般都是固体的合成 离子互换剂。一般氨基酸阐发仪所用的离子互换 树脂是强酸型阳离子互换树脂,它是由苯乙烯和 二乙烯聚合而成的。做为抱负的离子互换剂应符 合下列要求: ? 机械强度好 ? 不用融且具有很好的化学不变性 ? 平均球状颗粒 ? 当拆入柱子后应有优良的通透性 ? 互换容量大 ? 离子互换基应是单一的官能性的 3、离子互换道理 缓冲液(流动相)中的样品离子取离子 互换剂(固定相)间离子互换过程可分 为以下几步: 起首离子通过扩散感化,达到分手柱树 脂的概况。(这个过程进行的很是快) 离子进一步扩散到互换致使进入树 脂内部互换。这决定于树脂的交联 度和溶液的深度。这个过程是整个离子 互换反映的环节。 A. B. C. D. E. 正在互换长进行离子互换,这个均衡是 霎时的。被互换的离子带的电荷越多,它 取树脂的连系越慎密,被其它离子代替就 越坚苦。 被互换的离子通过树脂扩散到概况。 用洗脱液洗脱,被互换的离子扩散到溶液 中去。 ? 氨基酸取树脂间的互换次要决定于带有相 反电荷之间的引力感化。阳离子树脂本身 带有负电荷,两者正负吸引而连系,而且 氨基酸所带正电荷越多,连系得越慎密, 被Na离子置换就越坚苦。所以,碱性氨基 酸连系力最强,其次为芳喷鼻族氨基酸、中 性氨基酸、酸性氨基酸连系力最弱。 ? 所以,用分歧离子强度、PH值的缓冲 液顺次将氨基酸按吸附力的分歧洗脱 下来,被洗脱下来的氨基酸取茚三酮 反映液正在加热前提下反映(135℃), 生成可正在分光光度计中570nm的蓝紫 色物质(仲氨生成浅物质, 440nm检测)外标量。 (四)氨基酸阐发仪取HPLC法的比力 氨基酸阐发仪 30min HPLC 50min 卵白质水解物 心理体液 分手(苏/丝) 检测限量 定量切确度 操做 110min 95-98% 3pmol CV≤1.0% 简单 135min 85% 100pmol CV≤3% 复杂 三、样品的制备 (一)卵白质的水解 ? (二)逛离氨基酸样品的制备 ? (三)心理体液样品的前处置 ? (一)卵白质的水解 用于全氨基酸测定的样品,凡是以卵白质形式存正在 的都要进行水解处置,水解方式有三种: 1、酸水解法:尺度水解法,水解完全,但色氨酸被 。 2、碱水解法:用NaOH做为水解剂,色氨酸不被, 但有消旋感化,丝氨酸、苏氨酸等被。 3、酶水解法:水解前提暖和,无需特殊设备,氨基 酸不受破环,但水解时间长,并且不易水解完全。 (二)逛离氨基酸样品的制备 逛离氨基酸的样品正在阐发前必需进行 磨碎、脱脂、提取、脱盐、去卵白、 脱色等处置。正在进行阐发前利用 C18小柱处置一下。 (三)心理体液样品的处置 心理体液的样品起首要除去样品中 的卵白质,获得逛离氨基酸。除去 卵白质化学方式为: 1、苦味酸法 2、三氯乙酸法 3、乙醇沉淀法 4、磺基水杨酸法(常用的方式) 四、影响氨基酸阐发的各类要素 样品中氨基酸浓度的影响 ? 缓冲液PH值、钠离子浓度的影响 ? 柱温的影响 ? 氨的影响 ? 氧的影响 ? 光源的影响(钨灯) ? (一)样品中氨基酸浓度的影响 ? 每种仪器都有其比力合适的进样量,进 样浓度都有必然的范畴。浓度太大太小 都不适宜,特别是将高浓度的样品注入 仪器中会形成仪器管的堵塞。最好进 样阐发前将样品稀释到比力合适的浓度。 (二)缓冲液PH值取钠离子浓度的影响 ? 色谱图中各类氨基酸分手的出格好而没 有峰丢失,缓冲液的PH值和钠离子起着 主要的感化。如PH值和钠离子浓度不妥 会呈现氨基酸出峰提前错后以及堆叠现 象。 (三)柱温的影响 ? 柱温不不变或不精确会呈现基线漂 移或分手度欠好影响分手结果以及 精确定量。 (四)氨的影响 ? 缓冲液、样品、流系统混入氨进 可使基线正在碱性氨基酸出峰处将基 线抬高,影响碱性氨基酸分手结果 和精确定量。 (五)氧的影响 ? 反映液中的茚三酮最忌氧,茚三酮氧化 后即变质失效,所以茚三酮购入后必然 要妥帖保管,出格是不克不及正在空气中长时 间。缓冲液中的消融氧也会对茚三 酮显色结果形成影响。 (六)光源的影响 ? 光源欠安时,活络度会降低,达到规 按时间后该换就得换灯(利用刻日以 灯能量为准) 五、使用 ? 氨基酸是构成卵白质的根基单位,具有 极其主要的心理功能。氨基酸的检测分 析普遍使用于医学、农业、食物、医药、 饲料、化妆品等取人类糊口和健康亲近 相关的几大行业。 辨别 茶氨酸是茶叶的特征氨基酸,所以茶氨酸 的含量取茶叶质量和品级有间接关系。 ? 鱼粉是一种很好的卵白质饲料。它的氨基 酸构成特点是赖氨酸、蛋氨酸含量高。市 场上的鱼粉各类各样,氨基酸阐发成果很 容易就能够区别它的。 ? 感谢!